Laboratorio #3

Pruebas Cualitativas para Aminoácidos y Proteínas

Objetivos:

• Aplicar pruebas cualitativas generales y específicas que permitan reconocer grupos químicos de los aminoácidos y proteínas.

• Someter soluciones de proteínas a desnaturalización con agentes físicos y químicos.

Marco Teorico

Prueba de la ninhidrina (Hidrato de tricetohidrindeno).
Todas aquellas sustancias que presentan al menos un grupo amino y uno carboxilo libre, reaccionaran con la ninhidrina. La positividad se manifiesta por la aparición de un color violáceo o amarillo. Debido a que las proteínas y los aminoácidos, poseen esta característica, la reacción sirve para identificarlos. Algunas soluciones de amonio y aminas, dan la coloración característica, aparentemente debido a una oxidación y reducción intramolecular de la ninhidrina en presencia de amoníaco. Los aminoácidos porina e hidroxiprolina, que no poseen grupo amino sino imino (-NH-), dan un color rojo que pasa rápidamente a amarillo.

Prueba xantoprotica:
Es una reacción que reconoce los aminoácidos que poseen el grupo bencénico (tirosina, fenilalanina, triptófano). Las proteínas que tienen en su composición estos aminoácidos también darán la reacción. La positividad se reconoce por la aparición de un color amarillo o verde debido a la formación de nitrocompuestos

Prueba de Biuret:
Es una prueba general para polipéptidos y proteínas ya que sirve para reconocer las uniones peptidicas. La positividad se manifiesta por la aparición de una coloración violeta. La formación de un complejo de coordinación entre los cationes cúpricos en medio alcalino con las uniones peptídicas.

REACCIÓN DE LA CISTINA:

Esta reacción dará positiva con aquellos aminoácidos que presenten azufre en su estructura, como son la cistina, la cisteina y la metionina. La reacción consiste en someter la muestra a una hidrólisis alcalina con hidróxido de sodio.

R-SH + 2 NaOH   -    R-OH + SNa2 + H2O

REACCIÓN DEL TRIPTOFANO:

El grupo indol del aminoácido triptófano se condensa con el ácido glioxílico del reactivo, formando compuestos coloreados. El agregado de una pequeña cantidad de ácido sulfúrico concentrado puro, aumenta la sensibilidad de la reacción.

En este caso el precipitado fue la formación de un anillo color morado en la superficie de separación, reacción positiva.

Desnaturalización por calor y pH extremos:En bioquímica, la desnaturalización es un cambio estructural de las proteínas o ácidos nucleicos, donde pierden su estructura nativa, y de esta forma su óptimo funcionamiento y a veces también cambian sus propiedades físico-químicas.

Factores desnaturalizantes:

Los agentes que provocan la desnaturalización de una proteína se llaman agentes desnaturalizantes. Se distinguen agentes físicos (calor) y químicos (detergentes, disolventes orgánicos, pH, fuerza iónica). Como en algunos casos el fenómeno de la desnaturalización es reversible, es posible precipitar proteínas de manera selectiva mediante cambios en:

1. La polaridad del disolvente.
2. La fuerza iónica.
3. El pH.
4. La temperatura.

Reacción del ácido glioxílico para triptófano: El grupo indólico del triptófano reacciona con ácido glioxílico en presencia de ácido sulfúrico concentrado dando un complejo de color púrpura.  El ácido acético glacial que ha sido expuesto a la luz contiene ácido glioxílico.

Prueba para Arginina: El aa. Arginina contiene un grupo guanidino en la cadena lateral, este grupo reacciona con el reactivo de Sakaguchi (a-naftol/agua de Bromo) en medio alcalino para dar un compuesto de color rojo.

Precipitación con cationes y aniones pesados y sales concentradas: Los cationes de metales pesados y los aniones de elevado peso molecular son muy usados en la separación de proteínas y en la preparación de filtrados libres de proteínas.  A pH neutro por lo general las proteínas  tienen carga neta negativa y se combinan fácilmente con iones de metales pesados que, al neutralizar la carga producen la precipitación.  A pH por debajo del punto isoeléctrico en cambio, se combinan con  aniones porque presentan carga neta positiva.  Soluciones concentradas de sales, de sulfato de amonio, por ejemplo, reducen en gran medida la solubilidad de las proteínas, porque compiten por las moléculas de agua de disponibles para la solvatación y las interacciones proteína-proteína se hacen más importantes.

Materiales

Tubo de Ensayo

Gradilla

                            

Baño María

Gotero

  

Reactivos

Reactivo	Toxicidad
Tirosina	La piel: No produce irritaciones.  Ojo: No produce fuertes irritaciones.  Ingestión: Puede ser nocivo por ingestión. Inhalación: Puede ser nocivo si se inhala.
Triptófano	Por contacto ocular: Puede provocar irritaciones. Por ingestión e inhalación: Puede provocar irritaciones. En contacto con la piel: Puede provocar irritaciones. Riesgo de absorción cutánea. Observar las precauciones habituales en el manejo de productos químicos.
Cisteína	No se conocen datos concretos de esta sustancia sobre efectos por sobredosis en el hombre. No son de esperar características peligrosas. Observar las precauciones habituales en el manejo de productos químicos.
Cistina	Ojo: No produce fuertes irritaciones. Ingestión: Puede ser nocivo por ingestión. Inhalación: Puede ser nocivo si se inhala.
Prolina	Ojo: No produce fuertes irritaciones. Ingestión: Puede ser nocivo por ingestión. Inhalación: Puede ser nocivo si se inhala. Sensibilización: No se conoce ningún efecto
Arginina	Piel: No produce irritaciones. Ojo: No produce fuertes irritaciones. Ingestión: Puede ser nocivo por ingestión.
Caseina	Toxicidad aguda: No disponemos de datos cuantitativos sobre la toxicidad de este producto. Información complementaria sobre toxicidad: No deberían inhalarse las partículas
Ácido Nitrico	Inhalación: Una inhalación aguda de este producto produce estornudos, ronquera, laringitis, problemas para respirar, irritación del tracto respiratorio y dolor del tórax. Contacto con ojos: Produce irritación, dolor, lagrimeo, erosión de la córnea e incluso, ceguera. Contacto con la piel: Para la piel, es peligroso tanto líquido, como en forma de vapor. Causa quemaduras severas, la piel adquiere un color amarillo y se presenta dolor y dermatitis. Ingestión: Este ácido es muy corrosivo y puede destruir los tejidos gastrointestinales
Hidróxido de Sodio	Inhalación: La inhalación de polvo o neblina causa irritación y daño del tracto respiratorio. En caso de exposición a concentraciones altas, se presenta ulceración nasal. Contacto con ojos: El NaOH es extremadamente corrosivo a los ojos por lo que las salpicaduras son muy peligrosas, pueden provocar desde una gran irritación en la córnea, ulceración, nubosidades y, finalmente, su desintegración. Contacto con la piel: Tanto el NaOH sólido, como en disoluciones concentradas es altamente corrosivo a la piel. Ingestión: Causa quemaduras severas en la boca, si se traga el daño es, además, en el esófago produciendo vómito y colapso.
Acetato de Plomo	Inhalación: La irritación local del broncita y los pulmones pueden ocurrir y, en casos de la exposición aguda, los síntomas tales como gusto metálico, pecho y dolor abdominal, y los niveles crecientes de la sangre de plomo pueden seguir. Ingestión: ¡VENENO! Los síntomas del envenenamiento del plomo incluyen el dolor y los espasmos abdominales, náusea, vomitando, dolor de cabeza. Contacto de la piel: El plomo y los compuestos de plomo se pueden absorber a través de la piel en la exposición prolongada; los síntomas del plomo que envenenan descritos para la exposición de la ingestión pueden ocurrir. Contacto visual: La absorción puede ocurrir a través de tejidos finos del ojo pero los peligros más comunes son irritación local o abrasión.
Ácido Pícrico	Tóxico por inhalación. Puede producir tos y  dolor de garganta. Ojos: Puede producir irritación, enrojecimiento y dolor. Piel: Tóxico en contacto con la piel. Puede producir irritación y enrojecimiento. Ingestión: Tóxico por ingestión. Puede producir diarrea, vértigo, dolor de cabeza, nauseas y vómitos.
Ácido Tricloroacetico	Piel: Fuerte efecto cáustico en la piel y las mucosas. ojo: Fuerte efecto cáustico Ingestión: Puede ser nocivo por ingestión. Inhalación: El material es extremadamente destructivo para los tejidos de las membranas mucosas y las vías respiratorias superiores.

                                    Diseño experimental

Parte A:

 

Parte B:

Parte C:

 

Parte D:

 

Parte E:

Parte F:

Parte G:

 

Parte H:

 

Parte I: